激光掃描共聚焦顯微鏡已被證明是一種有用的工具，用于檢查固定和染色的細(xì)胞，組織，甚至整個生物體在高對比度下，通過消除從焦平面移除的區(qū)域產(chǎn)生的光。然而，熒光蛋白在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用越來越多，現(xiàn)在需要毫秒級的顯微鏡成像速度，以揭示許多生物過程中發(fā)生的復(fù)雜動力學(xué)。遺憾的是，傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡的采集速度受到振鏡的限制，振鏡是由一個線性鋸齒控制信號驅(qū)動的，速度為每像素幾微秒。這意味著掃描速率范圍從500毫秒到2秒，具體取決于圖像尺寸。為了在更快的時間尺度上獲取圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡必須重新設(shè)計，以納入先進(jìn)的掃描方案，使光束能夠以更高的速度光柵掃描穿過標(biāo)本。為了克服共聚焦顯微鏡固有的慢速，一些制造商引進(jìn)了配備共振掃描鏡的儀器，能夠以每秒30幀或更高的速度收集圖像。

圖1-帶線性和諧振電流計混合掃描系統(tǒng)的激光共焦掃描單元

圖1所示的是一個尼康A(chǔ)1R激光共聚焦顯微鏡掃描單元配備了許多先進(jìn)的功能，包括一個高分辨率振鏡掃描儀(4096 x 4096像素；非諧振)和高速諧振掃描儀，一個連續(xù)可變的六邊形針孔，光譜成像能力，幾個光輸出端口，以及一對不同波長的多個激光器的輸入端口。在A1R MP（多光子模型）中包含一個額外的自由空間光束引入端口，用于多光子成像所需的超快激光器。諧振掃描系統(tǒng)能夠以從每秒30幀（512 x 512像素）到每秒420幀（152 x 32像素）的速率進(jìn)行高速圖像捕獲，而非諧振掃描儀具有以512 x 512像素每秒4幀的最大掃描速率。諧振掃描儀的共焦變焦（從1.5倍到8倍）受到每一步單獨(dú)的Ronchi光柵圖案的要求的限制（下面討論），而非諧振掃描儀具有1倍到1000倍的連續(xù)可變變焦范圍。也許A1R掃描單元最先進(jìn)的功能是能夠同時使用兩臺掃描儀進(jìn)行混合掃描。在這種模式下，可以使用非諧振掃描儀對樣品的選定區(qū)域進(jìn)行光激活或光漂白，然后使用諧振掃描儀進(jìn)行高速成像，實時觀察光激活物種的恢復(fù)或擴(kuò)散情況。該儀器的真正力量在于多種功能，使高分辨率共聚焦成像固定標(biāo)本和實時掃描與可選的光激活活細(xì)胞成像使用熒光蛋白，光學(xué)熒光筆，和籠狀熒光團(tuán)。在預(yù)算有限的顯微鏡核心設(shè)施中，這種多功能性應(yīng)該能夠在單一儀器中容納更廣泛的用戶基礎(chǔ)。

雖然相對復(fù)雜的諧振振鏡已經(jīng)在商業(yè)上可用了三十多年，但它們在激光掃描共聚焦顯微鏡中的應(yīng)用尚未得到廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)90年代初，第一批點掃描儀器是在希望對活細(xì)胞中的快速鈣波成像的研究人員的實驗室中制造出來的。在幾份描述成功實驗的研究報告出現(xiàn)后，其他研究人員開始開發(fā)更復(fù)雜的儀器，包括包含共振掃描儀的多光子共聚焦儀。共振掃描顯微鏡的構(gòu)造由于高速共振掃描儀的余弦運(yùn)動而變得復(fù)雜，這就產(chǎn)生了像素時鐘問題。然而，在過去的十年中，已經(jīng)出現(xiàn)了一些可行的解決方案（基于硬件和軟件），使儀器能夠以視頻速率執(zhí)行正常的共聚焦功能，例如平移和縮放。這些儀器在未來幾年應(yīng)該會越來越受歡迎，并且毫無疑問能夠在速度和成像效率方面與旋轉(zhuǎn)磁盤和線掃描儀競爭。

在傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡中，激發(fā)光束被擴(kuò)展并引導(dǎo)到一對振蕩振鏡掃描鏡上，該掃描鏡對聚焦光束進(jìn)行光柵掃描。在進(jìn)入光電倍增管檢測器之前，通過相同的反射鏡組對熒光發(fā)射進(jìn)行反掃描，并通過共軛（共聚焦）針孔孔徑去除失焦光。在掃描和反掃描過程中，一個振鏡鏡沿著快速的水平軸掃描樣品，而另一個振鏡鏡掃描并跟蹤較慢的垂直軸。掃描繼續(xù)進(jìn)行，直到收集到完整的二維（x-y）圖像，隨著時間的推移，這個過程可以重復(fù)以生成一系列圖像�；蛘�，焦點可以沿著顯微鏡軸向平面步進(jìn)，以獲得光學(xué)切片的三維（x， y和z）圖像堆棧。掃描速度受到快軸反射鏡的機(jī)械規(guī)格的限制，它通常以每像素大約4到5微秒的速度掃描。因此，對于在一秒內(nèi)采集的512 × 512像素圖像，掃描點在每個像素上駐留約4微秒。以視頻速率（每秒30幀）驅(qū)動標(biāo)準(zhǔn)振鏡掃描儀來收集類似大小的圖像是困難的，如果不是不可能的話，因為鏡子必須快速加速，在掃描整個領(lǐng)域時保持恒定速度，然后迅速減速并反轉(zhuǎn)行進(jìn)方向，對每條掃描線重復(fù)這個循環(huán)。以每秒30幀的速度嘗試這樣的動作可能會導(dǎo)致過熱和過早失效。因此，非共振線性振鏡所要求的慢掃描速率限制了共聚焦顯微鏡觀察在非常快的時間尺度上發(fā)生的事件的能力。

快速樣本掃描的方法

使用基于振鏡的激光掃描共聚焦顯微鏡，最快的掃描場景包括使用線掃描沿著樣品的單個軸獲取一行像素，同時使用快軸反射鏡將慢軸反射鏡置于選擇適當(dāng)位置進(jìn)行掃描（圖2）。在現(xiàn)代共聚焦儀器中，掃描線不限于x軸，但可以定向在任何橫向方向，以包括所有感興趣的樣品特征。結(jié)果通常繪制為一系列掃描，偏移使熒光強(qiáng)度隨時間變化的可視化。這種方法可以產(chǎn)生高速掃描，但其檢測可能發(fā)生在標(biāo)本其他區(qū)域的事件的能力有限。快速線掃描的另一個缺陷是，每個像素上的停留時間通常不足以激發(fā)所有可檢測的熒光，特別是對于目標(biāo)豐度較低的樣品。此外，共聚焦顯微鏡中使用的光電倍增管的量子效率范圍約為15%至40%，因此隨著掃描速度的增加，每像素檢測到的光子數(shù)量可能會在一些樣品中下降到被光電倍增管的噪聲底所掩蓋的水平。

圖2所示為活細(xì)胞行掃描共聚焦顯微鏡的例子。圖2(a)所示的序列捕獲了由合成指示劑Fura Red在心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)的鈣火花的x - t掃描系列。注意在序列中連續(xù)時間點的幾個位置出現(xiàn)的高熒光強(qiáng)度區(qū)域。在圖2(b)中，使用熒光蛋白cameleon生物傳感器探針（含有mCerulean和mVenus）顯示了鈣波在分離的HeLa細(xì)胞中穿過細(xì)胞質(zhì)的圖像。獲得高空間分辨率的圖像（例如512 x 512像素）需要快速的x-y掃描，并且必須使用可以在毫秒內(nèi)掃描整個領(lǐng)域的顯微鏡進(jìn)行，例如以下段落中描述的儀器。使用配備線振鏡的共聚焦顯微鏡進(jìn)行快速線掃描，鈣波可以在一維上作為時間的函數(shù)記錄下來，如下圖所示。在圖2(c)中，沿著圖2(b)中的白色虛線進(jìn)行掃描，以捕獲波的單個空間維度，波在不到一秒的時間內(nèi)通過細(xì)胞。

圖2-線掃描共聚焦顯微鏡

另一種快速圖像采集策略包括增加像素停留時間而不降低幀速率，方法是將照明光束塑造成一條線，同時在一個軸上激發(fā)熒光團(tuán)，同時沿著另一條軸掃描樣品，以中等鏡像速度實現(xiàn)視頻幀速率（圖3(c)中示意性地示出）。這種掃描概念已經(jīng)在一種商用共聚焦儀器中實現(xiàn)，該儀器消除了快軸振蕩振鏡，并使用線性CCD陣列（line-CCD）捕獲熒光發(fā)射。因此，線掃描共聚焦顯微鏡可以通過線狀照明激發(fā)并通過共聚焦狹縫孔徑收集熒光發(fā)射來實現(xiàn)視頻幀率。線掃描共聚焦儀器的實際限制是不對稱的分辨率，這是由于一個軸的分辨率是由共聚焦掃描提供的，而另一個軸的分辨率是由傳統(tǒng)的寬視場光學(xué)限制的。此外，在技術(shù)上很難產(chǎn)生窄的衍射限制線的聚焦光與適當(dāng)大小的檢測狹縫耦合在分辨率不顯著低于理論的最佳。

商用狹縫共聚焦顯微鏡的解決方案依賴于使用不同寬度的狹縫孔徑（以改變共聚焦的程度），這些狹縫孔徑是通過在光學(xué)玻璃上沉積不透明材料的薄膜來制造的。掃描照明是由圓柱形透鏡元件形成的光楔，該透鏡元件以由物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定的角度匯聚在焦平面上。如前所述，狹縫掃描儀器能夠在分辨率下進(jìn)行高速圖像采集，僅受圖像點擴(kuò)散函數(shù)在軸向上的輕微退化的影響。缺點是，狹縫掃描儀目前依賴于線性單像素CCD探測器，其量子效率和噪聲特性與科學(xué)級CCD相似。這些探測器遠(yuǎn)不如電子倍增ccd （emccd）靈敏，因此需要更高的激發(fā)能量才能達(dá)到相似的信噪比。結(jié)果是在活細(xì)胞成像中快速的光漂白和高水平的光毒性，這限制了在偽影開始模糊實驗結(jié)果之前可以獲得的掃描次數(shù)。通過引入先進(jìn)的互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）或emccd型線性電荷耦合器件圖像傳感器，線掃描共聚焦顯微鏡將得到極大的改進(jìn)。

一種更先進(jìn)的高速共聚焦成像方法包括用多個平行光束掃描樣品，這些光束由旋轉(zhuǎn)的尼普科夫旋轉(zhuǎn)盤形成，或者通過掃描樣品上的網(wǎng)格陣列來平行捕獲所有圖像點。設(shè)計后一種儀器的關(guān)鍵要素是創(chuàng)建一個網(wǎng)格模式，能夠在一次掃描運(yùn)動中掃描整個場，同時保持照明和檢測針孔在足夠大的分離距離上，以防止針孔之間的熒光發(fā)射串?dāng)_。尼康“LiveScan”掃描場共聚焦顯微鏡是多點陣列掃描儀的一個很好的例子，它提供了具有不同針孔尺寸的可選網(wǎng)格的額外細(xì)化。該系統(tǒng)還可以選擇使用一組不同寬度的狹縫，以降低共焦度為代價，提供最大的激發(fā)能量和發(fā)射收集效率（圖3(b)）。在操作中，使用快速振鏡和壓電元件組合來控制鏡子并以視頻速率捕獲圖像，將32個照明點的網(wǎng)格掃過樣品場。在狹縫掃描模式下，掃描場共聚焦顯微鏡能夠以接近每秒1200幀的速度捕獲圖像。該儀器還能夠使用聲光可調(diào)濾波器（AOTF）激光控制，專用多波段二色鏡和匹配的濾光片組進(jìn)行多色熒光成像。此外，該顯微鏡可與高性能、低噪聲的EMCCD相機(jī)系統(tǒng)相結(jié)合，以最低的激發(fā)能對活體標(biāo)本進(jìn)行最有效的成像，從而最大限度地減少光漂白和光毒性。

圖3-高速共聚焦顯微鏡掃描機(jī)制

尼普科夫圓盤式旋轉(zhuǎn)圓盤共聚焦顯微鏡為活體標(biāo)本的快速掃描提供了一個極好的選擇。這些儀器是基于一個圓形的旋轉(zhuǎn)磁盤，其中包含一個或多個針孔陣列，排列成阿基米德螺旋，設(shè)計用于在單次磁盤旋轉(zhuǎn)期間掃描整個標(biāo)本平面（或更少的設(shè)計）。旋轉(zhuǎn)盤顯微鏡也可以操作狹縫而不是針孔，其代價是軸向分辨率降低。先進(jìn)的旋轉(zhuǎn)磁盤系統(tǒng)采用雙磁盤，雙磁盤包含位于上磁盤針孔陣列上方的微透鏡元件，其作用是將入射激發(fā)照明聚焦在下磁盤相應(yīng)的針孔上，從而顯著增加光吞吐量（如圖3(a)所示）。這種類型的儀器通常被稱為場、線或陣列掃描儀，因為它們在獲取每張圖像期間多次掃描場上的照明點或線陣列。旋轉(zhuǎn)磁盤顯微鏡的最高成像速度接近每秒2000幀，但是由于磁盤的高轉(zhuǎn)速需要通過樣品的同一部分多次的每個照明點，因此儀器通常難以達(dá)到如此高的速率。用于捕獲圖像（至少在全幀或半幀大�。┑臄�(shù)碼相機(jī)所需的長集成時間也限制了采集速度。旋轉(zhuǎn)盤顯微鏡通常使用激光、發(fā)光二極管或電弧放光燈照明，但當(dāng)配備適當(dāng)波長的固態(tài)激光器以匹配熒光團(tuán)激發(fā)峰時，其性能最佳。對于活細(xì)胞成像應(yīng)用，旋轉(zhuǎn)磁盤或其他陣列掃描共聚焦顯微鏡通常是選擇的儀器，特別是當(dāng)快速細(xì)胞動力學(xué)正在研究時。平行光束減少光漂白和光毒性，使成像時間更長。

能夠以視頻速率點掃描標(biāo)本的其他技術(shù)（盡管沒有商業(yè)化）包括配備聲光光束偏轉(zhuǎn)器的儀器(aod；圖3(d))，數(shù)字鏡像可編程陣列(dmd；圖4(b))，或旋轉(zhuǎn)多邊形鏡面（圖4(a)）。aod利用超聲波波陣面在晶體中產(chǎn)生壓力區(qū)，該壓力區(qū)可以衍射或偏轉(zhuǎn)入射激光，角度隨聲波頻率的變化而變化。這些固態(tài)器件得益于很少的運(yùn)動機(jī)械部件和可忽略不計的慣性，能夠產(chǎn)生幾乎瞬時反激的高精度鋸齒光柵掃描。此外，AOD掃描儀可以產(chǎn)生用戶定義的偏轉(zhuǎn)來生成感興趣的掃描區(qū)域。AOD顯微鏡的缺點是基于這些設(shè)備的色散特性，它只適用于單色光的受控通過。因此，寬帶熒光發(fā)射不能被解封，通常使用狹縫孔徑進(jìn)行共聚焦檢測，導(dǎo)致軸向分辨率降低，并且減少了對來自焦平面外區(qū)域的熒光的抑制。此外，為了使激光束的形狀與晶體的矩形孔徑相匹配，柱面透鏡是必要的。雖然這些問題已經(jīng)在一些實驗儀器設(shè)計中得到了解決，但使用AOD掃描儀的概念并沒有受到顯微鏡制造商的歡迎。

可編程陣列顯微鏡（PAMs）的特點是一個數(shù)字微鏡裝置，作為一個空間光調(diào)制器在圖像平面上產(chǎn)生一個廣泛的光譜的用戶定義的照明和檢測場景。這些儀器在選擇能夠在反射、透射和熒光模式下工作的光源方面具有很大的通用性，具有光學(xué)切片和多個同時感興趣的區(qū)域選擇能力。PAM儀器設(shè)計的核心是DMD單元，它由微型（約16微米）方形鏡面元件組成，可以單獨(dú)編程以相對于入射光和反射光旋轉(zhuǎn)“開”或“關(guān)”（如圖4(b)所示）。DMD使重復(fù)模式的使用，以增加光吞吐量的多路復(fù)用，他們是明顯快于在點掃描共聚焦顯微鏡中使用的振鏡。原則上，PAM儀器可以生成可以通過目鏡觀看的圖像和光學(xué)切片，熒光發(fā)射可以定向到科學(xué)級或電子倍增CCD相機(jī)系統(tǒng)。使用DMD設(shè)備的主要優(yōu)點是它們可以由軟件控制，沒有移動部件（除了微型鏡子），并且能夠使用兩個不同的鏡子位置來引導(dǎo)光通過單獨(dú)的光路。在這方面，PAM儀器比旋轉(zhuǎn)盤和狹縫掃描顯微鏡提供了更多的靈活性。然而，DMD顯微鏡在照明方面受到嚴(yán)重限制。照明光束必須擴(kuò)展到覆蓋DMD的整個表面，從而減少了任何特定鏡面段的可用光量，從而使激光照明源的應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性。

圖4-共聚焦顯微鏡的高速掃描設(shè)備

旋轉(zhuǎn)多邊形反射鏡系統(tǒng)的光束偏轉(zhuǎn)是一項成熟的技術(shù)，它使用光學(xué)簡單，非色散表面來創(chuàng)建具有基本鋸齒光柵的輸出光束，類似于傳統(tǒng)的視頻掃描。多邊形反射鏡（圖4(a)）已在過去的幾個商業(yè)和實驗共聚焦儀器中使用，但目前尚未由顯微鏡制造商實施。在實踐中，使用多角鏡需要相當(dāng)復(fù)雜的光學(xué)元件設(shè)計，并且這些單位在反射率和角度方面相對于旋轉(zhuǎn)軸容易發(fā)生微小的變化。這些角差被稱為錐體誤差，產(chǎn)生的光束波動必須進(jìn)行光學(xué)校正。由于多邊形面的數(shù)量必須與柵格掃描線的總數(shù)成比例，因此必須經(jīng)常制造專門的反射鏡來構(gòu)建共聚焦儀器。具有15、25或75個邊的多邊形必須分別以每分鐘63,000、37,800或12,600轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)，以便產(chǎn)生每秒15,750行的視頻速率掃描。這些高速需要專門的軸承，進(jìn)一步復(fù)雜的儀器設(shè)計。由于這些原因，基于多邊形鏡的共聚焦顯微鏡是罕見的，通常降級到特殊興趣項目。

與點掃描共聚焦儀器相比，旋轉(zhuǎn)盤、掃描場和線掃描共聚焦系統(tǒng)在光學(xué)切片性能方面都存在妥協(xié)。較差的性能是由于來自標(biāo)本偏遠(yuǎn)區(qū)域的光可以通過空間串?dāng)_泄漏到檢測器中，并且在成像高熒光厚組織標(biāo)本時變得更加嚴(yán)重。此外，一些商業(yè)上可用的旋轉(zhuǎn)盤儀器采用固定的針孔大小，不能由用戶調(diào)節(jié)，因此這些顯微鏡僅限于與特定物鏡放大兼容。這種情況在某種程度上好于市售的基于狹縫的旋轉(zhuǎn)磁盤顯微鏡，它提供可互換的磁盤來匹配物鏡分辨率和放大倍率。然而，上述段落中描述的大多數(shù)儀器都犧牲了最佳的衍射限制照明和檢測速度，并且無法產(chǎn)生商用激光點掃描共聚焦顯微鏡上可用的平移或變焦功能。盡管如此，這些顯微鏡能夠以視頻速率或更高的速度生成培養(yǎng)中薄的貼壁細(xì)胞的優(yōu)秀圖像。

共振掃描儀基礎(chǔ)

回顧傳統(tǒng)的單點激光掃描共聚焦顯微鏡，擴(kuò)展的激光束通過使用振鏡鏡在樣品上掃描，以連續(xù)改變光線通過物鏡后焦平面的角度。振鏡被戰(zhàn)略性地放置在彼此90度角，使掃描鏡的旋轉(zhuǎn)軸與它們自己的表面以及顯微鏡的光軸在遠(yuǎn)心平面上重合（與物鏡后焦平面共軛）。前后旋轉(zhuǎn)的振鏡鏡翻譯聚焦的激光光斑在一個光柵圖案，穿過橫向尺寸的領(lǐng)域橫跨試樣。一面鏡子(x)的左右旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生水平掃描線，而另一面鏡子(y)的上下旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生垂直偏轉(zhuǎn)。現(xiàn)代共聚焦儀器配備了先進(jìn)的掃描系統(tǒng)，賦予高度的靈活性，以形狀和尺寸的標(biāo)本區(qū)域被掃描。掃描角度可以通過重新分配x振鏡信號的一部分到y(tǒng)振鏡來旋轉(zhuǎn)，反之亦然。同樣，共焦變焦功能可以通過改變振鏡的角度掃描范圍來實現(xiàn)。掃描一個專門的用戶定義的區(qū)域的標(biāo)本的能力是特別有用的實驗，需要光激活或光漂白選定的區(qū)域，不具有矩形幾何形狀。

用于激光掃描顯微鏡的高性能伺服控制閉環(huán)振鏡是一項工程奇跡，它可以精確地旋轉(zhuǎn)附著的反射鏡，并在超過數(shù)十億個周期的使用壽命內(nèi)以極高的精度定位光束。振鏡的構(gòu)造方式類似于電動機(jī)，使用轉(zhuǎn)子和定子來驅(qū)動定位致動器的運(yùn)動，定位致動器包含整個組件，并根據(jù)其扭矩-慣性比做出響應(yīng)。根據(jù)振鏡的設(shè)計，轉(zhuǎn)子或定子是一個永久的磁性，與姐妹組件的線圈相互作用，產(chǎn)生驅(qū)動轉(zhuǎn)子的力。機(jī)械止動器用于將轉(zhuǎn)子運(yùn)動限制在有限的旋轉(zhuǎn)弧度內(nèi)。在大多數(shù)共聚焦顯微鏡中，由于其緊湊的尺寸，高定位精度，優(yōu)越的剛度和快速響應(yīng)，移動磁鐵驅(qū)動器是首選。振鏡鏡表面是一層銀或鋁薄膜，沉積在硅、熔融石英或鈹襯底上。振鏡最重要的要求之一是它們重量輕，由剛性材料制成，孔徑大小不限制光進(jìn)入物鏡孔徑，并且具有高度拋光的表面，其表面平坦到波長的一小部分。反射鏡必須在較寬的波長范圍內(nèi)（大約350到700納米）具有相同的反射性，并且反射面應(yīng)以掃描單元的旋轉(zhuǎn)軸為中心。

圖5-諧振電流計鏡掃描運(yùn)動

如上所述，由于慣性，伺服控制線性振鏡的掃描速度受到限制，因此，在標(biāo)準(zhǔn)幀尺寸下，只能以圖像采集速率對樣品進(jìn)行光柵掃描，通常范圍為每秒1至5張圖像。為了實現(xiàn)視頻速率，用于水平線掃描的較慢的線性振鏡可以用更快的共振掃描振鏡代替，該振鏡以固定頻率振動，相當(dāng)于音叉的旋轉(zhuǎn)。在諧振振鏡(也稱為逆旋轉(zhuǎn)掃描儀；CRS)，存儲在扭轉(zhuǎn)彈簧或桿組件中的能量用于以正弦波方式振蕩反射鏡。這些設(shè)備以4到8千赫茲的共振頻率循環(huán)，通常接近國家電視系統(tǒng)委員會（NTSC）視頻標(biāo)準(zhǔn)每秒15750線的水平頻率的比例部分。當(dāng)一個工作頻率為7900赫茲的共振掃描儀被用來獲取512條線，這些線以雙向方向逐步掃描（奇數(shù)線從左到右，偶數(shù)線從右到左），結(jié)果是單個線周期約為125微秒，圖像捕獲率為每秒30幀。

圖5中展示了幾種具有不同反射鏡孔徑的諧振振鏡設(shè)計（圖5(a)），以及說明反射鏡振蕩運(yùn)動的示意圖（圖5(b)）。高速（7.9千赫茲）諧振振鏡可以圍繞中心軸在每個方向上旋轉(zhuǎn)約12度。入射激光激發(fā)光從鏡面以物理鏡面位置決定的角度反射（覆蓋總范圍為24度）。如果根據(jù)振蕩周期的相位和速度來考慮鏡像運(yùn)動，則鏡像從相位為-2π（速度等于零）通過0（最大速度）過渡到+2π（速度等于零）。因此，正如下面將更詳細(xì)描述的那樣，在振蕩周期的末端，鏡面達(dá)到其最大角度時，速度最小（或為零），而在周期的中心，鏡面角度為零時，速度最大。

諧振振鏡掃描儀的主要優(yōu)點之一是，它們在振蕩周期中逐漸加速和減速，從而避免了在每個掃描線開始時需要復(fù)位信號。為了實現(xiàn)平滑運(yùn)動，先進(jìn)的掃描儀配備了兩個振蕩的質(zhì)量平衡扭轉(zhuǎn)桿，它們經(jīng)過機(jī)械調(diào)諧，在相反的相位共振，以建立相等但相反的扭矩，在外殼附著位置抵消。結(jié)果是一個無反應(yīng)的機(jī)械振蕩器，消除了擺動和外部振動。高速共振掃描儀上的反射鏡孔徑直徑約為5毫米，采用鍍銀或鍍鋁的光學(xué)級鈹制成，具有優(yōu)異的剛度重量比。這些振鏡的掃描角度范圍從15到26度，峰對峰。在振蕩過程中，如圖5(b)和圖6所示，諧振振鏡的角速度以余弦曲線的方式變化，在掃描角為0度時（掃描場中心）達(dá)到最大速度，在掃描角為90度時（掃描場邊緣）達(dá)到最小速度，此時掃描方向發(fā)生變化。當(dāng)使用共振掃描儀生成圖像時，這些非線性變化在像素時鐘方面提出了一個重大問題。

共振掃描器時鐘問題

由于共振掃描速度的非線性，熒光樣品在中心區(qū)域以最高速度掃描，隨著掃描到達(dá)邊緣，速度逐漸降低。因此，當(dāng)從共振掃描儀中獲得的圖像數(shù)據(jù)流用一個幀捕獲器以恒定的像素率（假設(shè)波束被線性掃描）進(jìn)行采集時，圖像在邊緣出現(xiàn)拉伸。此外，激光激發(fā)強(qiáng)度的不均勻分布（在邊緣更大）在掃描區(qū)域的邊緣產(chǎn)生過度的光漂白（和潛在的光毒性），因為增加了暴露于激光。補(bǔ)償掃描非線性的最簡單的選擇是將掃描范圍限制在振鏡速度幾乎是線性的振蕩周期的那一部分，這發(fā)生在跨越大約70%的總掃描寬度的區(qū)域。不幸的是，這種解決方案減少了可以收集發(fā)射信號的時間，增加了再次收集信號之前的掃描周轉(zhuǎn)時間，并且不能防止標(biāo)本落在被記錄區(qū)域之外的區(qū)域的光漂白。光漂白效應(yīng)可以最小化，然而，當(dāng)使用的振鏡振蕩的線性部分，結(jié)合可調(diào)的孔徑，限制了該地區(qū)的試樣被暴露在照明。

幸運(yùn)的是，非線性諧振振鏡掃描引起的圖像畸變是可預(yù)測的，并且可以使用軟件或硬件解決方案進(jìn)行校正。無論產(chǎn)生圖像的校正方案如何，最有效的掃描策略包括在振鏡的前向和后向掃描期間收集數(shù)據(jù)。在正向掃描期間記錄數(shù)據(jù)是直接的，但由于向后掃描顛倒了記錄像素的方向，因此必須使用專門的讀寫緩沖區(qū)或軟件反轉(zhuǎn)圖像數(shù)據(jù)。在實踐中，圖像以正常寬度的兩倍（實際上，最終圖像大小為512 x 512像素，為1024像素）和正常高度的一半（256像素）收集。在諧振振鏡的每個正向x軸掃描結(jié)束時，提供給線性(y)振鏡的垂直鋸齒信號增加一條線，并開始反向(x)掃描。以這種方式，垂直掃描順利進(jìn)行256個周期，直到獲得一張圖像的足夠數(shù)據(jù)。

圖6-具有線性像素時鐘的共振掃描共聚焦圖像

諧振掃描共聚焦顯微鏡的軟件和硬件時鐘解決方案都依賴于知道高頻諧振振鏡的位置數(shù)據(jù)。在7.9千赫茲的設(shè)備上，這個鏡子可以圍繞中心軸在每個方向上旋轉(zhuǎn)大約12度（總共旋轉(zhuǎn)24度）。反射鏡的角度位置（θ）和相位或速度（φ）的關(guān)系可以根據(jù)振蕩周期的狀態(tài)來預(yù)測。在振蕩周期的開始(鏡面位置等于正負(fù)12度；（見圖5和圖6），鏡子是靜止的，速度等于零。當(dāng)反射鏡向中點擺動時，角速度隨相位的余弦函數(shù)而增加，并在反射鏡角度為零時達(dá)到最大值。接著，當(dāng)它接近正向掃描的終點時，鏡子再次減速，直到它在瞬間逆轉(zhuǎn)方向時達(dá)到等于零的速度。當(dāng)鏡子向相反方向旋轉(zhuǎn)時，可以觀察到角速度的相同變化。諧振振鏡應(yīng)該考慮的另一個因素是，這些器件是高q振蕩器，即使在自然振鏡頻率與外部驅(qū)動源之間發(fā)生最輕微的漂移時，由于相位和幅度的響應(yīng)變化很大，因此無法有效地同步到外部頻率。因此，諧振振鏡本身應(yīng)用作主振蕩器，使所有其他定時元件同步。

共振掃描共聚焦顯微鏡的基于軟件的時鐘方案涉及算法，該算法能夠使用基于可預(yù)測的鏡子運(yùn)動的查找表對像素數(shù)據(jù)進(jìn)行線性化。例如，一種流行的算法首先確定鏡像和幀捕獲器的相位常數(shù)，然后定位最終圖像的中心像素。該算法圍繞對稱的中心平面運(yùn)行，在中心平面上，可以高精度地知道鏡子的位置。當(dāng)圖像被傳送到幀捕獲器時，通過一次檢查一條水平掃描線來處理圖像。從掃描儀接收的像素數(shù)據(jù)以最終圖像寬度的兩倍和最終高度的一半存儲。該過程的第一步涉及從水平掃描線的后半部分反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)點，然后將反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)在圖像的前半部分的數(shù)據(jù)線之間隔行（圖6(b)）。由于數(shù)據(jù)收集和觸發(fā)采集的水平同步信號啟動之間的滯后，圖像的中點可能無法確定，因此通常需要軟件將反轉(zhuǎn)掃描線偏移幾個像素。在這種情況下，掃描線的右邊緣可以作為圖像的參考點。該序列的下一步是對每個像素或相對于中心像素的相位位置應(yīng)用校正因子。然后將該像素重新定位到最終圖像中的正確位置（圖6(c)）。在理想的情況下，使用先進(jìn)的高速計算機(jī)，傳入的數(shù)據(jù)可以在飛行中進(jìn)行分析，并實時記錄到硬盤驅(qū)動器中。

硬件時鐘

由于諧振振鏡會隨著溫度和振幅的變化而漂移，并且是其他難以控制的變量的宿主，因此設(shè)計硬件時鐘機(jī)制的關(guān)鍵是精確確定掃描鏡在整個振蕩周期內(nèi)的瞬時角位置。目標(biāo)是每當(dāng)激光束在正向掃描時從左到右或在反向掃描時從右到左穿越均勻間隔的像素邊界時產(chǎn)生時鐘脈沖。這些時鐘脈沖在諧振振鏡的時間上不會均勻間隔。如上所述，這種差異的發(fā)生是因為角速度在掃描范圍的中心是最大的，在那里時鐘脈沖會更頻繁（大約有70納秒的間隔）。在極端情況下，當(dāng)振鏡開始改變方向時，時鐘脈沖將具有更大的間隔（接近160納秒）。在理想的情況下，時鐘脈沖被用來觸發(fā)光電倍增管輸出的模數(shù)轉(zhuǎn)換，每個像素將在最終圖像中代表一個相等的空間位移。已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來使用硬件對諧振掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行線性化（稱為掃描線性化），但最成功的兩種策略是模擬像素時鐘和實時測量反射鏡位置的光柵。

像素時鐘解決方案的一個例子是利用電壓控制振蕩器（VCO）和相位檢測器連續(xù)跟蹤振鏡的像素到像素和周期到周期的操作。一旦像素時鐘鎖定在掃描儀諧振頻率上，振蕩器就會向計數(shù)器計時，計數(shù)器訪問存儲像素位置與掃描速度相關(guān)信息的存儲芯片。存儲器將存儲的信息通過數(shù)模轉(zhuǎn)換器發(fā)送，該轉(zhuǎn)換器在閉環(huán)中饋送給壓控振蕩器。VCO接收的控制電壓用于校正時鐘頻率，以匹配掃描儀余弦速度的變化。作為交叉檢查，像素時鐘向相位檢測器發(fā)送每個像素觸發(fā)器的信號，相位檢測器將時序與掃描儀同步電子器件進(jìn)行比較。檢測到的相位誤差產(chǎn)生一個校正電壓，該電壓反饋到VCO，以保持與掃描儀的周期同步。VCO輸出用于在檢測器處對像素進(jìn)行時鐘處理。諧振振鏡制造商提供了幾種先進(jìn)的專有像素時鐘，作為其控制電子設(shè)備的選擇。然而，大多數(shù)生成的信號都是基于查找表的，并且不允許由于機(jī)械漂移而導(dǎo)致的掃描模式的小變化。

圖7-共振掃描共聚焦顯微鏡像素時鐘架構(gòu)

最先進(jìn)的基于硬件的像素時鐘能夠在整個掃描周期中直接跟蹤鏡子的位置，使用直接跟蹤鏡子運(yùn)動的輔助反饋系統(tǒng)獲得的光學(xué)數(shù)據(jù)。也許最好的例子是由Roger Tsien和Brian Bacskai首先描述的，并作為20世紀(jì)90年代初推出的第一臺商用共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)，該顯微鏡包含一個共振掃描儀，尼康RCM-8000。目前，高性能的尼康A(chǔ)1R共聚焦顯微鏡系統(tǒng)采用了類似的時鐘系統(tǒng)。簡而言之，尼康像素時鐘是基于使用一個輔助的低功率紅外激光系統(tǒng)來反射來自諧振振鏡的反向鏡面的定時光束。反射光束聚焦在一個透明和不透明條紋的光柵上（稱為Ronchi光柵），并沿著光柵與共振掃描器周期同步振蕩。通過光柵的光被記錄為強(qiáng)度變化，使用專用的光電二極管將信息提供給數(shù)字化圖像數(shù)據(jù)的電子元件。由于振鏡鏡的位置在其振蕩時被高精度地檢測到，因此像素時鐘非常準(zhǔn)確。

如圖7所示是一個示意圖，概述了諧振掃描共聚焦顯微鏡中基于Ronchi光柵的可變像素時鐘的光學(xué)列車的組成部分。像素時鐘的主要光學(xué)和電子元件如圖左側(cè)所示，包括一個低功率半導(dǎo)體近紅外激光源，一個包含不同間距Ronchi光柵的可旋轉(zhuǎn)磁盤，將反射的激光束聚焦到Ronchi光柵上的中間透鏡，以及一個檢測通過光柵的光脈沖的光電二極管傳感器。參與激發(fā)和成像光學(xué)序列的組件呈現(xiàn)在圖的右側(cè)，但為了簡單起見，將成像組件的數(shù)量減少到最小。請注意，附在圖7中的諧振振鏡的鏡子有兩面高反射表面，以適應(yīng)成像和時鐘激光。

在工作中，時鐘二極管激光器發(fā)出的光被定向到諧振掃描鏡的反射背面，而涉及成像系統(tǒng)的激光器發(fā)出的光從同一鏡子的正面反射。時鐘激光器的反射光被一個聚光透鏡聚焦，隨著振鏡的振蕩運(yùn)動同步掃過Ronchi光柵的表面。在光柵處，激光束被掃描穿過一系列交替的不透明線和等寬的透明空間。冷凝透鏡將時鐘光束聚焦到比光柵中的線間距小的尺寸，以確保光完全通過或部分被光柵阻擋，以依賴于振鏡位置的交替方式。為了消除衍射，一個關(guān)鍵點是激光光斑在光柵表面水平應(yīng)明顯小于光柵線寬。由振蕩振鏡引起的光強(qiáng)波動由光電二極管檢測，光電二極管位于光柵的正下方。

在諧振振鏡的水平掃描期間，時鐘光電二極管記錄由Ronchi光柵散射的激光脈沖，該脈沖可被電子轉(zhuǎn)換為具有可變頻率的像素時鐘。當(dāng)振鏡處于其振蕩周期的中心部分時，這些光脈沖將更頻繁，但當(dāng)鏡到達(dá)掃描結(jié)束并反轉(zhuǎn)方向時，它們將減慢。光電二極管檢測器的要求之一是能夠處理可變脈沖頻率（就帶寬而言），并且它必須足夠大以檢測整個線路掃描。探測器連接到一個跨導(dǎo)放大器，該放大器將光電二極管電流脈沖轉(zhuǎn)換為放大電壓，然后將其饋送到倍頻電路，使每行像素數(shù)加倍。光電二極管和相關(guān)的電子器件每條線路傳送256個脈沖，倍頻電路將該輸出轉(zhuǎn)換為每條線路512個脈沖，這些脈沖由幀捕獲器獲取并用于構(gòu)建圖像。

圖8-基于Ronchi光柵的諧振掃描像素時鐘

圖8展示了使用龍氏光柵耦合到光電二極管檢測器作為可變像素時鐘的基本概念。為了清晰起見，圖8(a)中所示的光柵只包含八個等寬的間隔，疊加一個諧振振鏡隨時間的完整余弦運(yùn)動周期(紅色曲線；125微秒)。實際的光柵有256行間距，并且在線性尺寸上更加緊湊，因為像素時鐘激光器實際上在運(yùn)行中沿著光柵表面回溯一條單線（垂直于不透明線）（圖8(b)）。當(dāng)光束進(jìn)入和離開Ronchi光柵的透明區(qū)域時，光電二極管檢測到的透射光強(qiáng)度隨著振鏡的運(yùn)動而上升和下降（圖8(c)）。光電二極管檢測到的光強(qiáng)度的每次轉(zhuǎn)換（在這種情況下，從暗到亮）用于生成觸發(fā)顯微鏡圖像捕獲的像素時鐘（圖8(d)）。盡管圖8(d)中所示的時鐘脈沖在時間上的間隔是非均勻的（范圍從大約70到160納秒），但它們在圖像空間中對應(yīng)于相等的間隔。

為了在相同的空間間隔（而不是在相同的時間增量）獲取像素樣本，光電倍增管信號從主顯微鏡成像系統(tǒng)通過具有可變增益和偏移的傳統(tǒng)放大器，然后由一個模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器由龍池光柵脈沖產(chǎn)生的像素時鐘觸發(fā)數(shù)字化。然而，由于諧振振鏡在兩個方向上掃描，一半的圖像信息被反轉(zhuǎn)。為了在構(gòu)建圖像之前糾正這種雙向掃描偽影，數(shù)字像素輸出首先傳輸?shù)较冗M(jìn)先出（FIFO）或后進(jìn)先出（LIFO），緩沖區(qū)取決于像素是從左到右還是從右到左獲取。因此，在振鏡的水平掃描期間，在掃描的前半段（62.5微秒的時間段）獲得的圖像像素被饋送到FIFO緩沖區(qū)，而在反向掃描期間獲得的像素被饋送到LIFO緩沖區(qū)。FIFO緩沖區(qū)在每次水平線采集開始時被讀取并重置為零，而LIFO緩沖區(qū)在傳入數(shù)據(jù)存儲期間向上計數(shù)，在隨后的讀出期間向下計數(shù)，以確保在反向掃描期間獲得的像素被反轉(zhuǎn)。

共振掃描的優(yōu)點

與旋轉(zhuǎn)圓盤、掃描場和旋轉(zhuǎn)多邊形顯微鏡不同，共振掃描激光共聚焦顯微鏡能夠在不改變物鏡的情況下改變放大倍率，通過使用通用的共聚焦變焦功能。變焦控制的物理基礎(chǔ)包括改變水平諧振振鏡掃描鏡和垂直線性振鏡的旋轉(zhuǎn)角度。較小的掃描角減少了被掃描試樣的面積，同時保持相同數(shù)量的像素，以有效地提供所選試樣細(xì)節(jié)的放大圖像。調(diào)用共焦變焦功能需要改變用于可變像素時鐘的Ronchi光柵中線的間距。圖7中的磁盤包含四種尺寸的Ronchi光柵，每個光柵都可以旋轉(zhuǎn)到像素時鐘光學(xué)序列中，以改變縮放系數(shù)。當(dāng)龍氏光柵中的線尺寸和間距尺寸減少一半（保持相同的總線數(shù)）時，變焦系數(shù)增加兩倍。同樣，減少光柵線尺寸尺寸的四倍增加變焦系數(shù)到4倍。可能的縮放設(shè)置的數(shù)量取決于可用于可變像素時鐘的Ronchi光柵尺寸的數(shù)量。尼康A(chǔ)1R激光共聚焦顯微鏡能夠從1倍到8倍的7個變焦步驟。交換光柵需要減少諧振振鏡的掃描角，這是使用預(yù)先存儲的信息在顯微鏡控制電子，協(xié)調(diào)振鏡掃描角與選定的光柵完成。

共振掃描振鏡動力學(xué)為成像采集速率提供了廣泛的選擇余地，只需改變所獲取圖像的尺寸，這與旋轉(zhuǎn)磁盤顯微鏡中區(qū)域陣列探測器的像素分割非常相似。雖然水平線的掃描速率是由振鏡的諧振周期固定的，但可以減少每個圖像使用的線的數(shù)量以產(chǎn)生更快的成像速率。因此，在圖像尺寸為512 x 512像素時，尼康A(chǔ)1R顯微鏡以每秒30幀的速度產(chǎn)生圖像。如果收集一半的垂直線來獲得尺寸為512 x 256像素的圖像，那么理論上幀速率將增加一倍，達(dá)到每秒60幀。請注意，由于在較高的速度下線性(y)振鏡重新定位的輕微延遲，圖像尺寸與速度的關(guān)系并不完全是線性的。對于尼康A(chǔ)1R顯微鏡，在共振掃描模式下可實現(xiàn)的最高掃描速率為每秒420幀，圖像尺寸為512 x 32像素。對于許多應(yīng)用，例如活細(xì)胞中的快速鈣波成像，降低垂直圖像尺寸是可以接受的犧牲，以增加速度。

圖9-串聯(lián)檢流計在共振掃描共聚焦顯微鏡中的應(yīng)用

圖9所示的是在活細(xì)胞中使用光學(xué)熒光蛋白的光轉(zhuǎn)換和光激活實驗，這明顯受益于串聯(lián)掃描和高速能力的組合，因此配備共振掃描共聚焦顯微鏡。圖9(a)至9(c)顯示了mEos2（一種紅到綠色的可光轉(zhuǎn)換熒光蛋白）與連接蛋白43縫隙連接組分融合標(biāo)記的縫隙連接中的光轉(zhuǎn)換，并在活的HeLa細(xì)胞中表達(dá)。選擇一小塊區(qū)域，用耦合到405納米激光器的線振鏡進(jìn)行光轉(zhuǎn)換（圖9(A)），然后用488納米激光器進(jìn)行成像(圖9（b)和9(c)）。圖9(d)至9(f)顯示了腎細(xì)胞中PA-GFP與人β -肌動蛋白融合的光活化。與圖9(a)相似，感興趣的區(qū)域用405納米激光照射，然后在488納米處成像。最后，利用紅光點燃熒光蛋白（KFP1）與線粒體靶向信號融合實現(xiàn)線粒體的光開關(guān)，如圖9(g)至9(i)所示。用561納米激光在熒光和差分干涉對比（DIC）模式下對標(biāo)記的線粒體進(jìn)行成像，如圖9(g)。在488納米光照下將標(biāo)記嵌合體完全“關(guān)閉”后，線粒體似乎沒有熒光（圖9(h)），可以通過再次在561納米下成像重新激活（圖9(i)）。使用光學(xué)熒光筆的研究可以用共振掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行，成像速度必要，以闡明各種時間尺度上的細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)。

這些成像技術(shù)是由尼康A(chǔ)1R掃描儀中的超選擇器實現(xiàn)的（見圖1），它將用于光激活的405納米光子轉(zhuǎn)移到振鏡掃描儀，使共振掃描儀自由地同時獲得光激活產(chǎn)物的高速圖像。振鏡掃描儀可以放大以限制刺激區(qū)域的大小（這可以顯著加速光激活）。在405納米光激活，同時使用共振掃描儀獲取圖像的能力擴(kuò)展到尼康A(chǔ)1R-MP多光子顯微鏡。

總結(jié)

傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡的主要缺點是圖像采集速度相對較慢，盡管它們具有高分辨率和從焦平面移除的熒光區(qū)域產(chǎn)生的光的排斥優(yōu)勢。共聚焦技術(shù)的主要技術(shù)限制是需要一個快速的水平（x軸）掃描鏡，能夠?qū)崟r每幀產(chǎn)生500或更多行。然而，即使在那些配備標(biāo)準(zhǔn)線性振鏡的點掃描共聚焦顯微鏡的相當(dāng)慢的掃描速率下，構(gòu)成單個像素的光束停留時間非常短，并且限制了可以收集的信號量。隨著提高共聚焦掃描速度的新技術(shù)的引入，比如共振振鏡，繼續(xù)提高點掃描共聚焦顯微鏡的速度只會導(dǎo)致信號量的減少，直到最終在最高速度下耗盡。這種壓倒一切的關(guān)鍵任務(wù)信號噪聲概念可能不公地導(dǎo)致了幾種替代高速成像技術(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)的光學(xué)切片性能較差，而代價是將工程精力集中在能夠視頻速率圖像捕獲的點掃描儀器上。

與預(yù)期相反，一些報道表明，配備共振掃描儀的高速點掃描共聚焦顯微鏡可能既能提高信號水平，又能減少預(yù)期的光漂白。這一意想不到的結(jié)果很可能源于合成熒光團(tuán)、量子點和遺傳編碼熒光蛋白極其復(fù)雜的光物理行為，所有這些似乎都能夠通過廣泛的尚未解釋的機(jī)制在不同程度上進(jìn)行光激活、光轉(zhuǎn)換和光開關(guān)。關(guān)于共振掃描共聚焦顯微鏡，增加的熒光信號可能產(chǎn)生于激發(fā)照明劑量依賴的響應(yīng)，該響應(yīng)由快速掃描調(diào)制以產(chǎn)生增加的信號水平。通常，這樣的響應(yīng)應(yīng)該取決于聚焦激光光斑的直徑和光束掃描樣品的速度。結(jié)果模擬了熒光團(tuán)的脈沖照明。由于脈沖照明可以將熒光團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎祷?ldquo;關(guān)閉”光開關(guān)狀態(tài)，從而避免進(jìn)入三重態(tài)，因此熒光發(fā)射水平增加，而光漂白率有所降低。這些報告尚未得到廣泛的實驗驗證，但在檢查活體和固定標(biāo)本的快速共聚焦成像結(jié)果時，應(yīng)牢記這些報告。

共振掃描共聚焦顯微鏡，一種仍在發(fā)展和完善的技術(shù)，應(yīng)該被證明是一種有用的方法，用于檢查大量的生物問題，使用細(xì)胞，組織和完整的生物體，在視頻速率成像對實驗至關(guān)重要的條件下。能夠同時利用共振和線性振鏡進(jìn)行高速成像串聯(lián)特定區(qū)域感興趣的光激活或光漂白在優(yōu)越的光學(xué)切片分辨率是一個額外的好處，不能輕易實現(xiàn)與其他技術(shù)。最復(fù)雜的儀器能夠結(jié)合視頻速率共聚焦掃描與光譜成像使用專門的探測器，以進(jìn)一步提高這些顯微鏡的效用。例如，使用熒光蛋白FRET生物傳感器成像鈣波需要非�？斓牟杉�速度，因為波可以在不到一秒的時間內(nèi)穿過細(xì)胞。使用傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡，鈣成像幾乎是不可能的，但有了像尼康A(chǔ)1R這樣的儀器，可以實時捕獲波，并且可以用光譜探測器解開兩個熒光團(tuán)對FRET發(fā)射光譜的貢獻(xiàn)。這種類型的實驗，以及無數(shù)其他的，將在未來受益于共振掃描激光共聚焦顯微鏡的檢查。

轉(zhuǎn)自：光子位

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